細菌RNA提取試劑盒(DNase I)說明書
RNApure Bacteria Kit(DNase I)
細菌RNA提取試劑盒(DNase I)
Cat. No. K0539
保存:DNase I、10×Reaction Buffer:-20℃
其它組分:室 溫
組分說明
Cat. No. K0539
Kit Size 50
DNase I 1000 U
10×Reaction Buffer 1000 μl
Buffer RL 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2(concentrate) 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Shredder Spin column 50
Spin Column RM 50
Collection Tube(1.5 ml) 50
Collection Tube(2 ml) 100
產品簡介
本試劑盒采用高效、專一結合核酸的離心吸附柱和*的緩沖系統,可從細菌或培養的動物細胞中快速提取總 RNA。
30-40 分鐘內即可完成反應,提取的總 RNA 純度*,沒有蛋白質和其他污染,適用于 RT-PCR、Real-Time RT-PCR、
芯片分析、體外翻譯等實驗。
注意事項
1. 預防RNase污染,應注意以下幾方面:
1)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。
2)玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。
3)配制溶液應使用無RNase的水。
4)操作人員戴一次性kouzhao和手套,實驗過程中要勤換手套。
2. Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇至終濃度為 1%,如 1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的
Buffer RL 4℃可保存 1 個月,如出現沉淀,請加熱溶解后使用。
3. 第-次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。
5. 如未特殊說明,所有離心步驟均在室溫下進行,且所有操作步驟動作要迅速。
自備試劑:Lysozyme(YJ0887)、β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA)
操作步驟
1. 4℃ 10,000 rpm(~13,400×g)離心2分鐘收集菌體(菌體量大不超過1×109 ),小心去除所有上清。
注意:上清如果有殘留,會影響后續的消化過程。
2. 用含有Lysozyme的100 μl TE緩沖液*重懸菌體,室溫孵育。具體配方和孵育時間如下:
TE 緩沖液中 Lysozyme 的終濃度 孵育時間
G 細菌 400 μg/ml 3-5 分鐘
-
G+ 細菌 3 mg/ml 5-10 分鐘
3. 加入350 μl裂解液RL(使用前請檢查是否加入β-巰基乙醇),渦旋震蕩混勻(此步驟可能出現不溶性沉淀),將溶液與沉淀全部加入到已裝入收集管(Collection Tube 2 ml)的過濾柱(Shredder Spin Column)中,10,000 rpm離心 2分鐘。
4. 向上步得到的濾液中加入250 μl無水乙醇,混勻(此時可能會出現沉淀)。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱(Spin Column RM)中(吸附柱已裝入2 ml收集管中),10,000 rpm離心1分鐘,棄掉廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1,10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
6. 配制DNase I 混合液:取52 μl RNase-Free Water,向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I(1U/μl),混勻, 配制成終體積為80 μl的反應液。
7. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液,20-30℃孵育15分鐘。
8. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1,10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇), 10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液。
10. 重復步驟9。
11. 將吸附柱放回收集管中,10,000 rpm離心2分鐘。
注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除,乙醇殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR等)。
12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free的1.5 ml 收集管中,向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water,室溫放置1分鐘,10,000 rpm離心1分鐘,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。
注意:1) RNase-Free Water 體積不應小于 30 μl,體積過小影響回收率。
2) 如果要提高RNA的產量,可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟12。
3) 如果要提高RNA濃度,可將得到的溶液重新加入到吸附柱中,重復步驟12。
實驗代做服務:
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