黃曲霉毒素B1(AFB1)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)
本試劑盒僅供研究使用。
1 使用目的:
本試劑盒用于玉米、大米、麥類(lèi)、豆類(lèi)、花生、花生醬中黃曲霉毒素B1(AFB1)殘留的定量檢測(cè)。
2 實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,在微孔板包被有黃曲霉毒素B1(AFB1)偶聯(lián)抗原,加入黃曲霉毒素B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品,游離黃曲霉毒素B1(AFB1)微孔條上預(yù)包被的黃曲霉毒素B1(AFB1)偶聯(lián)抗原互相競(jìng)爭(zhēng)抗黃曲霉毒素B1(AFB1)體酶標(biāo)記物,用TMB底物顯色,加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色,用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè),吸光值與樣品中黃曲霉毒素B1(AFB1)含量成反比,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃曲霉毒素B1(AFB1)的含量。
3 試劑盒組成
3.1 預(yù)包被的黃曲霉毒素B1(AFB1)偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板:1塊(12孔×8條)。
3.2黃曲霉毒素B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)品:6瓶(1ml/瓶),含量分別是:0 ppb 0.2 ppb,0.6 ppb,1.8ppb,5.4ppb ,16.2ppb。
3.3抗黃曲霉毒素B1(AFB1)抗體酶結(jié)合物:1瓶(6ml)。
3.4顯色液A:1瓶(6ml)。
3.5顯色液B:1瓶(6ml)。
3.6終止液:1瓶(6ml),2M硫酸。
3.7樣本稀釋液:1瓶(10×, 6ml),用于樣品稀釋用。
3.8濃縮洗滌液:1瓶(20×,20ml),用于洗板。
3.9說(shuō)明書(shū)一份。
4 需要而未提供的材料
4.1 設(shè)備
4.1.1波長(zhǎng)450nm酶標(biāo)儀。
4.1.2粉碎機(jī)。
4.1.3量筒。
4.1.4振蕩器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman No 1或相當(dāng)?shù)臑V紙。
4.1.7微量移液器。
4.2 試劑
4.2.1去離子水或蒸餾水。
4.2.2 甲醇。
5 貯存
5.1 試劑盒貯存于2~8℃,切勿冷凍
5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存
6 注意事項(xiàng)
6.1 使用試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。
6.2 不要使用過(guò)期試劑盒。
6.3 試劑盒使用前,將試劑恢復(fù)至室溫(25±2℃),建議至少回溫2小時(shí)。
6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有黃曲霉毒素B1(AFB1),使用時(shí)應(yīng)特別注意,操作時(shí)應(yīng)帶手套。
6.5 終止液中含有硫酸,使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。
6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用,否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。
6.7 不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用;不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用,否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6.8 稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液,否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6.9 混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。
7 工作液準(zhǔn)備
7.1黃曲霉毒素B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液:0 ppb 0.2 ppb,0.6 ppb,1.8ppb,5.4ppb ,16.2ppb
7.2 濃縮洗滌液:用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用
7.3 樣本稀釋液:已備用
7.3 顯色劑:已備用,避免光線直照
7.4 反應(yīng)終止液:已備用
8 樣品處理:(樣品在提取過(guò)程中,要嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作,提取過(guò)程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋?zhuān)駝t會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存)
一般樣品處理
8.1取10g粉碎的樣品,加 20ml 70%甲醇溶液
8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘
8.3用Whatman No 1濾紙過(guò)濾
8.4取100µl處理后的樣品,加入400µl樣本稀釋液
8.5取100μl稀釋液進(jìn)行分析
動(dòng)物組織前處理
8.6準(zhǔn)確稱(chēng)取1±0.05 g勻漿后的組織樣品到50 ml的聚苯乙烯離心管中;加入3ml乙腈--丙酮提取溶液,2000rpm劇烈震蕩20s后4000r/min以上離心5min
8.7取上清液0.8ml在50℃氮?dú)饬飨麓蹈?/span>
8.8加入3.2mL樣品稀釋液, 750rpm渦旋20s
8.9取100ml用于分析
飼料前處理方法
8.10準(zhǔn)確稱(chēng)取1±0.05 g粉碎飼料樣品到50 ml的聚苯乙烯離心管中;加入4ml乙腈,1ml丙酮,2000rpm劇烈震蕩20s后4000r/min以上離心3min
8.11取上清液0.7ml在50℃氮?dú)饬飨麓蹈?/span>
8.12加入2.8mL樣品稀釋液,渦旋20s,混勻后取100ml用于分析
牛奶前處理方法
8.13取1 ml牛奶樣品到5 ml聚苯乙烯離心管中;加入4ml樣品稀釋液,混勻后取100ml用于分析
奶粉前處理方法
8.14準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3g奶粉樣品到7 ml的聚苯乙烯離心管中;加入2ml PBS溶液,2 ml正己烷,震蕩混勻
8.154000r/min以上離心5min,去除有機(jī)層和中間層,取下層溶液100ml到400ml 樣品稀釋液
8.16混勻后取100ml用于分析
9 酶免分析步驟
9.1 實(shí)驗(yàn)須知
9.1.1 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前請(qǐng)將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫(25±2℃),時(shí)間約2小時(shí)。回溫至室溫(25±2℃)后再取出微孔條,多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注:一定保證回溫充分,否則影響檢測(cè)的度和準(zhǔn)確度。
9.1.2 使用后請(qǐng)立即將試劑放回2~8℃保存
9.1.3 請(qǐng)不要改變分析程序
9.1.4 請(qǐng)使用的微量移液器
9.1.5 操作一旦開(kāi)始,請(qǐng)不要中斷任何程序
9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序,請(qǐng)嚴(yán)格按照要求操作
9.1.7 為避免交叉污染,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣
9.1.8 加樣時(shí)請(qǐng)勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面
9.2 分析步驟
9.2.1 預(yù)先進(jìn)行編號(hào),標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置,推薦進(jìn)行雙孔檢測(cè)
9.2.2 取所需數(shù)量的微孔(微孔條可拆),將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3 樣品稀釋液、濃縮洗滌液(20×)稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)
9.2.4 在B0孔中加入50µl0.0 ppb標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液
9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗黃曲霉毒素B1(AFB1)抗體酶結(jié)合物
9.2.8 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。
9.3 37℃溫浴30min (溫浴過(guò)程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板,可以減少雙孔誤差)
9.3.1 甩掉孔中液體,用洗液洗滌微孔板5次,zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。
9.4 反應(yīng)
9.4.1 洗滌程序完成后,立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50µl顯色液A,再加 50µl顯色液B;輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之*混勻
9.4.2 37℃溫浴10min
9.4.3 每孔中加入50µl終止液,混勻
9.4.4 在450nm下檢測(cè)吸光度,結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
10 結(jié)果計(jì)算
10.1定量分析
10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0 ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
10.1.2以黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度的對(duì)數(shù)值為X軸,百分吸光度值為Y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值,可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo),即為黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度的對(duì)數(shù)值,求得反對(duì)數(shù)即為測(cè)定液中黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度C(ppb)
10.1.3由于樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋?zhuān)虼烁鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。
10.2 半定量測(cè)定
10.1.1目測(cè)半定量測(cè)定:首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較,判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
10.1.2儀器半定量測(cè)定:首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較,判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
11 特異性
物質(zhì) 交叉反應(yīng)
黃曲霉毒素B1(AFB1)100%
12 試劑盒參數(shù)
本試劑盒檢測(cè)下限為0.2 ppb
B0吸光度*值應(yīng)大于1.0
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8%,板間誤差小于15%。
用本說(shuō)明書(shū)提供的組織樣本提取方法回收率大于80%。
13 標(biāo)準(zhǔn)曲線模式(僅供參考)
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.2 ppb ~16.2 ppb。
14 分析限制
本試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。
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