平行反應監測技術(PRM) :
PRM是一種基于高分辨、高精度質譜的離子監視技術,能夠對目標蛋白質、目標肽段(如發生翻譯后修飾的肽段)進行選擇性檢測,從而實現對目標蛋白質/肽段進行定量。PRM技術基于Q-Orbitrap為代表的高分辨、高精度質譜平臺,首先
利用四級桿質量分析器的選擇能力,用Q1選擇目標肽段的母離子,隨后在Collision cell中對母離子進行碎裂,后利用Orbitrap分析器在二級質譜中檢測所選擇的母離子窗口內的所有碎片信息。這樣即可對復雜樣本中的目標蛋白質/肽段進行準確地特異性分析。
實驗意義:
PRM技術是針對無抗體蛋白的驗證新技術,用于label free, iTRAQ, TMT, SILAC等相對定量蛋白質組數據的驗證,或對復雜樣本中的目標蛋白質進行靶向定量分析。
實驗步驟:
用PRM進行蛋白質組數據驗證的一般步驟為:
結果展示
實驗完成周期及交付標準:
1.實驗周期: --般PRM時間為: 5-10天
2.交付標準:
組學驗證:
①主要儀器、試劑和實驗方法。
②PRM目標離子信息:肽段序列和定量子離子。
③方法學重復性評價:三次技術重復的色譜峰面積相對標準偏差(RSD) (預實驗結果) 。
④實驗結果:二級圖譜,XIC圖譜,原始峰面積強度值,矯正后的相對表達量,兩組樣本間的相對比值,ttest p值。
相對/定量:
①主要儀器、試劑和實驗方法。
②PRM目標離子信息:肽段序列和定量子離子。
③方法學評價:相對定量的重復性評價-測試樣本的三次技術重復的色譜峰面積相對標準偏差(RSD) (預實驗結果) ;
定量的方法學評價-標準品XIC圖譜,LOD, LOQ,線性范圍, 6個稀釋梯度得到的標準曲線及線性公式(每個稀釋度有3次技術重復)。
④實驗結果:
相對定量:二級圖譜,XIC圖譜,原始峰面積強度值,矯正后的相對表達量,兩組樣本間的相對比值,ttest p值。
定量:二級圖譜,XIC圖譜,原始峰面積強度值,根據標準曲線計算得到的蛋白質濃度值,兩組樣本間的相對比值,ttest p值。
需確認的信息:
1.樣品:
①如果樣品為蛋白質溶液,蛋白質總量≥300mg;
②如果是組織樣品,樣品總量≥0.1g;如果是細胞樣品,細胞數量≥107個;
③如果是體液樣品,血清≥200ml,腦脊液≥200ml, 尿液≥1ml,淚液≥1ml。
2.樣品采集過程中使用到塑料制品時,盡量使用無色進口產品,以減少塑料制品中雜質對質譜檢測的影響。
文獻參考
[1] Navin Rauniyar. Parallel Reaction Monitoring: A Targeted Experiment Performed Using High Resolution and HighMass Accuracy Mass Spectrometry. IntJ Mol Sci. 2015 Dec; 16(12): 28566- -28581.
實驗代做服務:
ELISA試劑盒免費代檢測 | CCK8檢測 | 基因組DNA提取
| 蛋白相互作用分析 |
Western Blot
| 免疫組化 | 熒光定量PCR | 動物模型服務 |
流式細胞檢測 | 細胞增殖 | 激光共聚焦 | DNA甲基化實驗 |
細胞劃痕 | 鈣離子濃度檢測 | 掃描電鏡實驗 | microRNA 測序 |
動物實驗 | Taqman探針 | ATP/ADP檢測
| 石蠟/冰凍切片 |
定點突變 | 線粒體膜電位(MMP)檢測 | 細胞生長曲線的測定 | 藥理毒理動物實驗
|
免疫共沉淀 | 真核表達載體構建 | 染色質免疫沉淀CHIP | 非標定量(Label-free)實驗 |